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La promiscuidad catalítica y la halogenación de productos naturales:

26 noviembre, 2010 8 comentarios

Como hemos podido comprobar en anteriores posts, los seres vivientes son unos químicos orgánicos sintéticos excelentes. Los sistemas vivos son capaces de llevar a cabo reacciones con una estereoselectividad milimétrica, generar una diversidad química apabullante y, no menos importante, hacerlo en condiciones muy suaves comparadas con las presiones, la acidez o la temperatura que requieren determinadas síntesis orgánicas in vitro.

En el post de hoy me hago eco de un artículo publicado recientemente en Nature en el que se aprovechan de la diversidad metabólica bacteriana para incrementar la riqueza sintética que las plantas ostentan. Es bien conocido el interés sintético que presentan las halogenaciones en el mundo de los fármacos puesto que nos permiten, sin grandes cambios en la naturaleza química de la molécula, salvar la resistencia al agente químico que los seres vivos acaban desarrollando o modular la potencia del fármaco. Realizar halogenaciones en productos naturales de utilidad farmacológica puede resultar costoso si se lleva a cabo por vías de síntesis orgánica, sin embargo, existen halogenasas bacterianas capaces de halogenar regioselectivamente sustratos mediante un mecanismo redox dependiente de FAD a partir del anión haluro correspondiente. El grupo de O’Connor utiliza estas enzimas para aumentar la versatilidad sintética del metabolismo secundario de la apocinácea (como nuestra amiga Nerium oleander) Catharanthus roseus, que produce a partir de triptófano un conjunto de alcaloides de interés farmacéutico como determinados agentes quimioterapéuticos.

Catharanthus roseus

Ruta de síntesis de alcaloides a partir de triptófano de Catharanthus roseus. En rojo, se indican los pasos y los enzimas añadidos

La aproximación tomada por los autores del artículo pasa por la transformación de la apocinácea en lugar de reconstruir la ruta metabólica de interés (por otro lado parcialmente desconocida) en un chasis de menor complejidad metabólica como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae como hizo el grupo de Ro con la artemisinina.  Utilizando Agrobacterium rhizogenes como vector consiguen plantas con dos halogenasas bacterianas que cloran el indol del triptófano en posición 5 y 7 respectivamente. En el inserto, incluyen la reductasa que permite la regeneración de la flavoproteína así como uno de los enzimas de la ruta modificado para incrementar su promiscuidad catalítica (en el caso de la halogenasa que modifica la posición 5). Con las plantas transformadas y cultivadas en medio enriquecido en cloruro, los autores demuestran que el nuevo producto generado por el sistema introducido es compatible con el resto de enzimas de la ruta cuya promiscuidad catalítica había sido considerada in vitro en trabajos anteriores. Finalmente, se detectaron por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas los productos clorados en la posición de interés. Además de caracterizar cinéticamente los enzimas, los autores demuestran que pueden utilizar bromuro como sustrato in vivo incrementando todavía más las opciones sintéticas de estas plantas trasformadas. En definitiva, un trabajo que abre las puertas a nuevas aproximaciones biotecnológicas basadas en la combinación lineal de rutas existentes en los tres dominios de la vida y en la promiscuidad catalítica de los enzimas que las componen.

 

 

Cromatograma mostrando la detección del producto clorado de interés. Se muestra el patrón, el control y el procedente de las plantas transformadas.

 

 

Cromatogramas correspondientes a extractos de plantas tranformadas cultivadas en presencia de concentraciones crecientes de bromuro. Se observa la presencia de los picos correspondientes al patrón.

 

Referencias:

W. Runguphan, X. Qu and S. E. O’Connor. (2010) Integrating carbon-halogen bond formation into medicinal plant metabolism. Nature 468:461-464

La aproximación umpolung de la transaminación

22 noviembre, 2010 7 comentarios

El principio de Curie establece que la asimetría de los efectos debe estar presente en la causas, es decir, de una causa simétrica no pueden generarse efectos asimétricos. La asimetría de la causa, por el contrario, no lleva necesariamente a un efecto asimétrico pudiéndose obtener efectos más simétricos que las causas. Como puede verse, de acuerdo con esta intuición, al igual que los griegos pensaban de los números pares, la simetría es poco fecunda al no poder más que engendrar simetría.  Este galimatías de simetría puede ejemplificarse perfectamente en las reacciones de síntesis orgánica en las que intervienen elementos de quiralidad. La aplicación del principio de Curie resultaría de explicar las posibles desviaciones de los productos del racemato (composición equimolecular de ambos enantiómeros) por la intervención de reactivos o entornos quirales que generasen estados de transición de diferente energía desviando la reacción  a uno de los enantiómeros.

 

Uno de los ejemplos más apabullantes de mantenimiento de la asimetría lo encontramos en la homoquiralidad de toda la vida conocida. Los seres vivos que pueblan la tierra utilizan en la construcción de sus biopolímeros sólo uno de los enantiómeros posibles de las unidades químicas que los componen. Esta selectividad genera catalizadores quirales que se imponen a los mecanismos de reacción generalmente simétricos para obtener los monómeros asimétricos.  La homoquiralidad es un argumento a favor de la ancestralidad común de nuestro bioclado y su fortaleza quedará explícita cuando logremos detallar la ruptura espontánea  de la quiralidad que parece presentar la vida.

 

La síntesis de aminoácidos nos puede servir como ejemplo de ruptura de la quiralidad promovida por un catalizador asimétrico en los sistemas vivos. Para ello, repasaremos previamente la reacción de síntesis abiótica de aminoácidos de Strecker. Si queremos sintetizar un aminoácido sencillo como la serina de acuerdo con este mecanismo, debemos partir de su aldehído correspondiente, el glicoaldehído, cuya imina será objeto de una adición nucleofílica de cianuro para obtener un a-aminonitrilo que posteriormente sufrirá hidrólisis resultando en el a- aminoácido.  La síntesis requiere de medio ácido que es proporcionado por uno de los reactivos, el ácido cianhídrico, a su vez, la fuente del nucleófilo (cianuro) que se adiciona al carbonilo. Como detalla la Figura 1, primeramente se forma, en medio ácido, la imina del aldehído, que luego sufre la adición del cianuro.

Figura 1: Mecanismo de reacción de la síntesis de Strecker. Se muestra la formación de la imina y la posterior obtención del nitrilo. (Tomado de http://www.organic-chemistry.org/)

El carbonilo del producto inicial de la reacción presenta un tipo de proquiralidad  conocido como proquiralidad facial, puesto que se genera un carbono quiral por el cambio de hibridación sp2 a sp3 durante la adición. La proquiralidad se conserva en la imina y  la adición puede ser por una de las dos facies o caras –re o si- (Figura 2) dando, si no se presentan asimetrías, una mezcla racémica de los productos. Es en este momento de la reacción en el que se establece la isomería final de los productos puesto que la consecutiva hidrólisis del nitrilo (Figura 3) no produce ningún cambio en la configuración del carbono quiral.

 

Figura 2: Proquiralidad del carbonilo, se indican las caras re y si. (Tomado de http://www.wikipedia.org/)

 

Figura 3: Mecanismo de reacción de la síntesis de Strecker: Se muestra la hidrólisis del nitrilo para obtener el aminoácido. (Tomado de http://www.organic-chemistry.org/)

El mecanismo de biosíntesis de aminoácidos procede de un modo distinto.  Una vez incorporado el amonio como glutamato y glutamina, la transaminación de a-cetoácidos es la etapa que determina la quiralidad de los aminoácidos. En el caso de la serina, la ruta de síntesis habitual (Figura 4) parte del 3-fosfoglicerato de la glicólisis para obtener por oxidación el a-ceto-β-hidroxiácido correspondiente. El 3-fosfohidroxipiruvato será el que se transamine para dar fosfoserina que tras hidrolizarla se obtendrá serina.

Figura 4: Rutas de obtención de serina. (Tomado de (http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html/)

 

La reacción bioquímica de transaminación transcurre de un modo radicalmente distinto al del mecanismo de Strecker al invertir la polaridad del grupo carbonilo. Este tipo de reacciones conocidas como umpolung permiten incrementar la versatilidad química del grupo y poder llevar a cabo reacciones de adición electrófila al mismo. La transaminación acontece en el centro activo de unas proteínas conocidas como transaminasas que presentan como coenzima el fosfato de piridoxal (PLP). El PLP es una piridina tetrasustituida unida al enzima mediante una imina con el e-amino de una lisina del centro activo.  La transaminación ocurre en varias etapas siendo la primera de ellas la recepción del grupo amino del glutamato y la consecuente ruptura de la imina interna con el e-amino. A continuación, el grupo amino libre forma una imina con el a-cetoácido y se produce la pérdida de un protón para dar el intermediario quinoideo (Figura 5) (se asemeja una quinona) que presenta una forma resonante carbaniónica de gran contribución al híbrido de resonancia (podemos interpretar que la carga negativa se encuentra deslocalizada por el anillo, estabilizando el carbanión). En este punto, hemos invertido la naturaleza electrofílica del grupo carbonilo permitiendo la adición de un protón (electrófilo). La reacción termina con la regeneración de la imina interna con la lisina y liberación del aminoácido.

 

Figura 5: Mecanismo de formación del intermedio carbaniónico quinoideo (Tomado de Vederas et Floss, 1980).

Como hemos visto, la reacción de transaminación presenta diferencias sustanciales con la síntesis de Strecker, tanto en los productos de partida  e intermedios (aldehídos vs a-cetoácidos) como en la reactividad del  grupo carbonilo (adición nucleófila vs adición electrófila), sin embargo la diferencia de mayor relevancia biológica la encontramos en la estéreoespecificidad. De nuevo, la imina presenta proquiralidad facial, pero a diferencia que en el mecanismo de Strecker, sólo una de las caras es atacada. Las transaminaciones catalizadas por enzimas conservan la asimetría preservando la homoquirliadad de los polímeros biológicos. La conservación de dicha quiralidad, a diferencia del racemato producido en la síntesis de Strecker, requiere invocar el principio de Curie y dado que ambos mecanismos propuestos son simétricos la diferencia la deberemos buscar en el elemento quiral de la reacción: el enzima.  Quedarnos con esta respuesta seria muy ingenuo por lo que debemos indagar en la naturaleza íntima de la asimetría. Dentro de las explicaciones propuestas, el efecto de la matriz asimétrica, que es la proteína, en la conformación final del carbono proquiral es la más plausible. La estabilización por resonancia del intermedio carbaniónico exige la perpendicularidad del grupo entrante (o saliente) para la correcta interacción con el sistema p de la molécula (Figura 6). De acuerdo con esta restricción, la matriz proteica fija la conformación mediante interacciones del carboxilo cetoácido con una arginina conservada, exponiendo sólo la cara adecuada a la protonación (Figura 7).

Figura 6: Efecto estereoelectrónico en la orientación de los sustituyentes. Se observa como el enlace a formar o romper debe encontrarse perpendicular al anillo para lograr el máximo solapamiento con el sistema  (Tomado de Toney, 2004).

Figura 7: Fijación de la configuración del C por interacción del carboxilo con el enzima (E+). Se muestra como un cambio en la esteroquímica del carbono cambia el grupo reactivo perpendicular al sistema  (Dunathan,1966).

De este modo, el catalizador asimétrico mantiene la fecunda asimetría de los sistemas biológicos y cuya explicación final es uno de los grandes misterios de la química prebiótica de nuestro tiempo.

Referencias:

M. I. Ávalos. (2004) Symmetry breaking: an epistemological note. Tetrahedron: Asymmetry 15:3171-3175

H. C. Dunathan. (1966) Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 55:712

A. Strecker. (1850) Ueber die künstliche Bildung der Milchsäure und einen neuen, dem Glycocoll homologen Körper. Justus Liebigs Ann.Chem. 75:27-45

M. D. Toney. (2005) Reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. Arch.Biochem.Biophys. 433:279-287

J. C. Vederas and H. G. Floss. (1980) Stereochemistry of pyridoxal phosphate catalyzed enzyme reactions. Acc.Chem.Res. 13:455-463

 

 

El video del viernes + infinito: Quiralidad.

19 octubre, 2010 Deja un comentario

La quiralidad es la propiedad que exhiben determinados objetos asimétricos cuyas imágenes especulares no son superponibles. La palabra viene del griego cheir, manos, puesto que estas no son superponibles entre sí. Una de las propiedades que permitió descubrir esta característica de determinadas moléculas es la conocida como actividad óptica o giro del plano de la luz polarizada. Las moléculas que presentan elementos de quiralidad como un plano, un eje o un centro quiral giran el plano de la luz polarizada siendo dicho giro opuesto para cada una de las formas especulares o enantiómeros (del griego enantios –opuesto- y meros –parte-).

El video que acompaña esta pequeña entrada muestra tres viales; dos de ellos contienen disoluciones enantioméricamente puras con los isómeros especulares opuestos y el tercero sólo lleva agua. Con la ayuda de uno de los dos polarizadores seleccionamos un plano concreto de luz polarizada que deberá desviarse en una dirección u en otra al atravesar los viales con los enantiómeros y permanecer en el mismo plano al atravesar el que contiene agua. El segundo polarizador nos permite ver el efecto pues cuando se encuentra perpendicular al plano de la luz no debe dejar pasar la radiación electromagnética oscureciendo la imagen. De este modo, podemos observar la actividad óptica opuesta de los dos enantiómeros con un polarímetro casero.

Invirtiendo la polaridad

15 octubre, 2010 1 comentario

Los sistemas vivos son unos excelentes químicos orgánicos, a temperatura ambiente, sin grandes presiones y sin reflujos son capaces de realizar las más complicadas síntesis con el máximo cuidado estereoquímico, preservando la homoquiralidad de la que la vida terrestre es garante. Pues bien, un claro ejemplo es uno de los sistemas catalizadores más antiguos presentes en el bioclado actual, nuestro amigo el ribosoma, que sin pestañear cataliza la formación de la amida del enlace peptídico engarzando los aminoácidos en los collares catalíticos que son las proteínas. Por el contrario, la formación de una amida preservando la estereoquímica no es una tarea tan fácil para un químico orgánico. Los métodos de síntesis orgánica de amidas convencionales pasan por condensar un ácido carboxílico (electrófilo) con una amina sustituida (nucleófilo) en una reacción que requiere la participación de agentes deshidratantes si se quiere obtener un buen rendimiento dado que el equilibrio se encuentra desplazado a reactivos. Además, si los sustituyentes de los reactivos son voluminosos la reacción se ve impedida en gran medida. No obstante, lo peor de estos métodos es la falta de estereoespecificidad de la reacción que produce frecuentemente mezclas de enatiómeros nada deseables si se les quiere dar un uso biológico a las posibles amidas peptídicas a sintetizar.

Aunque existen métodos efectivos de síntesis de péptidos como la síntesis en fase sólida que le valió el Nobel a Robert Bruce Merrifield en 1984 se sigue intentando resolver el problema en disolución. Una estrategia elegante que logra solucionar este problema es la desarrollada por Shen et al que intercambia la polaridad de los reactivos para que lograr la síntesis de la amida por un mecanismo distinto que no comprometa la estereoquímica de los productos. Esta tipo de aproximación es conocida por su nombre en alemán umpolung (polaridad reversa) y en este caso consiste en obtener una amina electrófila iodándola y un análogo nucleófilo del grupo carbonilo: un halonitroalcano. Con esta estrategia no sólo se consigue mejorar el rendimiento de la reacción sino obtener péptidos que mantienen la estereoisomería deseada. Los autores del artículo demuestran esto con aminoácidos inusuales como la aril glicina y con los 20 de relevancia biológica abriendo un nuevo campo para la síntesis de amidas de estos productos, al menos en química fina.

 

 

Reacción de una "aril glicina" con un aminoácido biológico

 

B. Shen, D. M. Makley and J. N. Johnston. Umpolung reactivity in amide and peptide synthesis. Nature 465:1027-1032

Diseño de enzimas: las Diels-Alderasas

21 julio, 2010 11 comentarios

La reacción de Diels-Alder es de excepcional importancia en química orgánica puesto que es esteroespecífica y regioselectiva y permite obtener una multitud de compuestos cíclicos (incluso heterocíclicos) de gran utilidad en síntesis orgánica. No en vano, les valió a sus descubridores Otto Paul Hermann Diels y Kurt Alder el premio Nobel de química en 1950. La reacción requiere de un dieno conjugado y un dienófilo como reactivos. Se trata de una reacción concertada es decir, no presenta intermedios, y transcurre a través de un estado de transición cíclico.

Esta sencillez mecanística junto con la ausencia de la reacción en los organismos biológicos han motivado a los investigadores del grupo de Siegel a desarrollar un enzima de Novo que catalice dicha reacción. El artículo publicado en Science es un ejemplo de un trabajo excelente tanto a nivel teórico como experimental. El enzima fue diseñado in silico para catalizar una reacción Diels-Alder concreta (sustratos moderadamente solubles) estabilizando el estado de transición gracias a la formación de dos puentes de hidrógeno con los sustratos. Se utilizaron cálculos mecánico cuánticos para evaluar dicha estabilización generada por la modificación de la distribución electrónica. Tras esto se determinaron computacionalmente un centros catalíticos capaces de acomodar los sustratos en la dirección deseada y presentar los residuos catalíticos en la posición adecuada. La aproximación utilizada requiere de una esqueleto proteico como base que soporte el centro catalítico sin provocar grandes distorsiones en la estructura de la proteína. Tras obtener varias Diels-Alderasas, sintetizaron y purificaron dichas proteínas obteniendo con éxito enzimas solubles capaces de catalizar la reacción. El trabajo de Siegel et al se completa caracterizando cinéticamente las enzimas (que muestran una mayor eficiencia catalítica y estereoespecificidad que la reacción sin catalizar) y determinando las causas de las diferencias observadas en cuanto a la catálisis. El trabajo realiza los oportunos controles siendo uno de ellos el determinar la estructura de las proteínas sintetizadas para evaluar como de coherentes son con los modelos computacionales. En definitiva, se trata de una investigación ejemplar en las que experimento y teoría establecen el elegante diálogo que no deja el mal sabor de boca a incompletitud al que nos tienen acostumbrados los artículos científicos.

J. B. Siegel, A. Zanghellini, H. M. Lovick, G. Kiss, A. R. Lambert, J. L. St Clair, J. L. Gallaher, D. Hilvert, M. H. Gelb and B. L. Stoddard. (2010) Computational Design of an Enzyme Catalyst for a Stereoselective Bimolecular Diels-Alder Reaction. Science 329:309