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Archive for the ‘Metabolismo’ Category

La promiscuidad catalítica y la halogenación de productos naturales:

26 noviembre, 2010 8 comentarios

Como hemos podido comprobar en anteriores posts, los seres vivientes son unos químicos orgánicos sintéticos excelentes. Los sistemas vivos son capaces de llevar a cabo reacciones con una estereoselectividad milimétrica, generar una diversidad química apabullante y, no menos importante, hacerlo en condiciones muy suaves comparadas con las presiones, la acidez o la temperatura que requieren determinadas síntesis orgánicas in vitro.

En el post de hoy me hago eco de un artículo publicado recientemente en Nature en el que se aprovechan de la diversidad metabólica bacteriana para incrementar la riqueza sintética que las plantas ostentan. Es bien conocido el interés sintético que presentan las halogenaciones en el mundo de los fármacos puesto que nos permiten, sin grandes cambios en la naturaleza química de la molécula, salvar la resistencia al agente químico que los seres vivos acaban desarrollando o modular la potencia del fármaco. Realizar halogenaciones en productos naturales de utilidad farmacológica puede resultar costoso si se lleva a cabo por vías de síntesis orgánica, sin embargo, existen halogenasas bacterianas capaces de halogenar regioselectivamente sustratos mediante un mecanismo redox dependiente de FAD a partir del anión haluro correspondiente. El grupo de O’Connor utiliza estas enzimas para aumentar la versatilidad sintética del metabolismo secundario de la apocinácea (como nuestra amiga Nerium oleander) Catharanthus roseus, que produce a partir de triptófano un conjunto de alcaloides de interés farmacéutico como determinados agentes quimioterapéuticos.

Catharanthus roseus

Ruta de síntesis de alcaloides a partir de triptófano de Catharanthus roseus. En rojo, se indican los pasos y los enzimas añadidos

La aproximación tomada por los autores del artículo pasa por la transformación de la apocinácea en lugar de reconstruir la ruta metabólica de interés (por otro lado parcialmente desconocida) en un chasis de menor complejidad metabólica como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae como hizo el grupo de Ro con la artemisinina.  Utilizando Agrobacterium rhizogenes como vector consiguen plantas con dos halogenasas bacterianas que cloran el indol del triptófano en posición 5 y 7 respectivamente. En el inserto, incluyen la reductasa que permite la regeneración de la flavoproteína así como uno de los enzimas de la ruta modificado para incrementar su promiscuidad catalítica (en el caso de la halogenasa que modifica la posición 5). Con las plantas transformadas y cultivadas en medio enriquecido en cloruro, los autores demuestran que el nuevo producto generado por el sistema introducido es compatible con el resto de enzimas de la ruta cuya promiscuidad catalítica había sido considerada in vitro en trabajos anteriores. Finalmente, se detectaron por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas los productos clorados en la posición de interés. Además de caracterizar cinéticamente los enzimas, los autores demuestran que pueden utilizar bromuro como sustrato in vivo incrementando todavía más las opciones sintéticas de estas plantas trasformadas. En definitiva, un trabajo que abre las puertas a nuevas aproximaciones biotecnológicas basadas en la combinación lineal de rutas existentes en los tres dominios de la vida y en la promiscuidad catalítica de los enzimas que las componen.

 

 

Cromatograma mostrando la detección del producto clorado de interés. Se muestra el patrón, el control y el procedente de las plantas transformadas.

 

 

Cromatogramas correspondientes a extractos de plantas tranformadas cultivadas en presencia de concentraciones crecientes de bromuro. Se observa la presencia de los picos correspondientes al patrón.

 

Referencias:

W. Runguphan, X. Qu and S. E. O’Connor. (2010) Integrating carbon-halogen bond formation into medicinal plant metabolism. Nature 468:461-464

No tan sinónimos

22 septiembre, 2010 5 comentarios

La complejidad de los sistemas vivos en niveles de regulación nunca deja de sorprendernos. Esta semana se ha publicado en science un artículo acerca del sorprendente destino de dos proteínas (β-actina y γ-actina) con una secuencia aminoacídica casa idéntica y que presentan funciones celulares distintas virtud regulación diferencial por estar la isoforma β arginilada (se le ha añadido cotraduccionalmente al extremo N terminal una arginina). Lo verdaderamente intrigante en relación a estas proteínas es cómo puede presentarse sólo una de las isoformas arginiladas si ambas presentan casi los mismos aminoácidos. La respuesta al problema parece hallarse en las secuencias, pues ambas proteínas se encuentran codificadas en genes distintos y presentan notables diferencias a nivel nucleotídico. De este modo, Zhang et al evaluaron computacionalmente discrepancias a nivel de plegamiento del mRNA de las proteínas prediciendo una menor tasa de traducción para la γ-actina. Paralelamente, llevaron a cabo experimentos para esclarecer el papel de esta traducción más lenta en la ausencia de γ-actina arginilada. De acuerdo con los experimentos del grupo de Zhang, la menor tasa de traducción conllevaba la exposición de una lisina el tiempo suficiente como para ser ubiquitinada y degradada posteriormente por el proteasoma. Aunque queda mucho trabajo por hacer para confirmar este mecanismo, estos indicios abogan a replantearse una vez más acerca de qué entendemos por sustitución sinónima y cómo de robustos son realmente los sistemas celulares.

Differential Arginylation of Actin Isoforms Is Regulated by Coding Sequence–Dependent Degradation , Fangliang Zhang, Sougata Saha, Svetlana A. Shabalina, and Anna Kashina Science 17 September 2010: 1534-1537.

Alcanos bacterianos

3 agosto, 2010 52 comentarios

La escasez de los combustibles fósiles está impulsando toda aquella investigación cuyos subproductos puedan quemarse en un motor de combustión. Gracias o no a esta situación, esta semana se ha publicado en science un trabajo que identifica y caracteriza los enzimas responsables de la síntetis de alcanos en cianobacterias. Los modelos estudiados hasta ahora con dicha actividad eran eucariotas (podemos encontrar alcanos en la cutícula de las hojas o como feromonas) sin embargo, había indicios fuertes de que dicha actividad se encontraba presente en diversos grupos de cianobacterias. El grupo de Schirmer utilizó los abundantes datos genómicos de este phylum para identificar a los enzimas responsables de dicha actividad. Primeramente, cultivaron 11 cianobacterias de genoma conocido y evaluaron la presencia de alcanos en los cultivos. De los positivos, intersectaron sus genomas y encontraron diversos genes con función desconocida comunes a todos las bacterias cultivadas. De los genes hipotéticos más plausibles dos resultaron ser los correspondientes a las enzimas implicadas en la síntesis, en la que un ácido graso se reduce a aldehído para luego descarboxilarse. La función de los genes putativos se confirmó mediante estudios knock in en Escherichia coli y knock out en Synechocystis sp.

A la izquierda los cromatogramas del control y el knock out para Synechocystis sp. A la derecha la ruta de síntesis de alcanos con los enzimas descubiertos.

El estudio se completó caracterizando cinética y mecanísticamente las enzimas implicadas. De nuevo un trabajo completo que da gusto leer y que abre nuevos caminos en el campo de los biocombustibles.

A. Schirmer, M. A. Rude, X. Li, E. Popova and S. B. del Cardayre. (2010) Microbial Biosynthesis of Alkanes. Science 329:559

The long path of carbon in photosynthesis II

23 marzo, 2010 2 comentarios

El camino hacía la ruta de la fijación del carbono estaba preparado. El descubrimiento previo del isótopo de C14 y la técnica analítica de la cromatografía en papel bidireccional fueron fundamentales para que el grupo de Calvin realizara experimentos acerca del destino del CO2 fijado en la fotosíntesis. El principio del experimento era sencillo, el CO2 acaba incorporándose en todos los materiales vegetales, principalmente y en primera instancia en los carbohidratos. La intención del grupo de Calvin era reducir el tiempo de viaje de esta molécula para discernir la ruta de fijación del CO2 (pulso y caza). Para ello, se suministraba 14CO2 a un organismo fotosintético y se detenía la reacción a tiempos adecuados matando al organismo con metanol hirviente al 80%. El metanol servía para dos propósitos, detenía la reacción inutilizando los enzimas y extraía los azúcares para su posterior análisis cromatográfico.

Los experimentos preeliminares confirmaron la separación, ya documentada, entre las fases luminosa y oscura de la fotosíntesis. El montaje consistía en un aparato llamado por Calvin y sus colaboradores lollipop, por su forma de piruleta, en el que crecían algas del género Chlorella preilumindas, almacenando suficiente poder reductor como para llevar acabo la fijación de CO2 en las condiciones de oscuridad posteriores. Estos experimentos de corta preiluminación y luego oscuridad eran poco viables al no ir mucho más allá del poder reductor almacenado en ese breve período de tiempo, por eso decidieron hacer experimentos en fotosíntesis en fase estacionaría (CO2 y iluminación constantes).

Las cromatografías se revelaban en una película fotográfica sensible a la radiación del C14. Determinando luego los compuestos con radiactividad incorporada a los diferentes tiempos de iluminación y analizando posteriormente la distribución de la radiación en cada compuesto con el tiempo se podía obtener una familia de curvas del incremento de radiación de cada compuesto respecto al tiempo.

Para determinar la ingente cantidad de compuestos presentes en un organismo fotosintético, se ensayaron numerosos procedimientos. En primera instancia, se utilizaron los métodos analíticos clásicos de la química orgánica, pero la lentitud y el requerimiento de grandes cantidades de material biológico para el análisis hicieron que fueran sustituidos por otros procedimientos. Dada la experiencia del grupo de Calvin en los años de guerra en separar plutonio y otros elementos radiactivos en columnas de intercambio iónico, utilizaron este método para determinar que los compuestos marcados a tiempos cortos eran de naturaleza aniónica. Debido a la dificultad en eluir después los componentes radiactivos de las resinas, parecía plausible que el material era de naturaleza acídica, disponiendo de varios puntos de unión a la resina.  Aunque esta técnica presentaba resultados, se necesitaba de otra que permitiese resolver a la vez todos los componentes del extracto en menos tiempo.

La técnica de la cromatografía bidimensional en papel permitía la separación de aminoácidos, azúcares y otros compuestos. Al grupo de Calvin le sirvió para analizar de manera rápida los productos marcados presentes en los extractos de algas fotosintéticas. El fundamento de esta técnica subyace en la pérdida de agua de la solución solvente a medida que se desplaza por el papel. Las separaciones son el  resultado de la partición entre la fase orgánica en movimiento y la fase acuosa estacionaria. El coeficiente de partición de cada sustancia es particular y puede proporcionarnos información para identificarlo. De este modo, la solución se vuelven más orgánica, separándose los solventes aniónicos, como los azúcares fosfatos, con el solvente rico en agua mientras que los más hidrofóbicos como los lípidos y los pigmentos permanecen en la fase orgánica. El uso de dos solventes diferentes y la rotación del papel 90º ( cromatografía bidimensional), permitía una resolución de las sustancias similares. Las cantidades relativas de los compuestos se podían determinar cualitativamente de las autoradiografías o cuantitativamente previa elución. Se realizaban cromatografías paralelas con compuestos patrones para ayudar a establecer las propiedades de la manchas.

Los primeros resultados de estas cromatografías mostraron que, en apenas 30 segundos, el carbono marcado había pasado a una gran variedad de compuestos. Si querían obtener la relación temporal entre las distintas sustancias debían acortar el tiempo de exposición. Efectivamente, al reducir el tiempo, algunos de estos compuestos no mostraban radiactividad, indicando que se trataba de compuestos que se sintetizaban en pasos tardíos de la ruta de fijación del carbono. El primer producto de la fotosíntesis, cuando el tiempo de esta se reducía  a apenas unos segundos, era un ácido carboxílico, el 3-fosfoglicerato, tal y como lo encontraron Ruben y Kamen.

Se disponía del inicio del ciclo, del primer producto de la fijación del CO2, siendo la determinación del aceptor el próximo compuesto a determinar. La degradación de los intermediarios marcados, permitía establecer la cantidad de radiación en cada carbono del compuesto. De este modo, se llegó a establecer que el 3-fosfoglicerato estaba inicialmente marcado en el grupo carboxilo. Es fácil de ver por qué Calvin y sus colaboradores pensaron que el aceptor inicial era un compuesto de dos carbonos. En la búsqueda de este aceptor de dos carbonos se identificaron muchos de los otros compuestos que aparecían en las cromatografías. Tras realizar muchos experimentos, aparecieron dos nuevas manchas que no correspondían con ninguno de los compuestos que ya conocían. La primera mancha desconocida resultó ser para su sorpresa, un azúcar de siete carbonos, la sedoheptulosa, recibiendo confirmación por comparación con sedoheptulosa de Arnold Nordal. El segundo compuestos era la ribulosa-1,5- bisfosfato, ninguno de ellos el compuesto C2.La búsqueda fútil del compuesto C2 terminó cuando consideraron la posibilidad de que el aceptor inicial fuese un compuesto con cinco carbonos. Estudiando el marcaje radioactivo de los carbonos de la sedoheptulosa y la ribulosa-1,5-bisfosfato, establecieron las rutas de síntesis de estos compuestos a partir de  combinaciones de otros compuestos identificados.

Aun habiendo determinado los caminos por los cuales se podían generar todos los intermediarios del ciclo; pentosas, hexosas y  heptosas, se presentaba el problema adicional de que todos ellos aprecian simultáneamente junto con la triosa. Para dilucidar finalmente quien era el aceptor inicial del ciclo decidieron utilizar datos cinéticos. Se apoyaron en el hecho que los compuestos se saturaban con radiactividad muy rápidamente indicando que eran las concentraciones de estos en estado estacionario. Los efectos de la luz en las concentraciones de los intermediarios sirvieron para determinar el aceptor del ciclo. Para probarlo bidireccionalmente, se hicieron experimentos similares en los que el alga era suministrada CO2 marcado y luego era transferida atmósferas con CO2 ausente, se detectaba la disminución de la mancha del 3-fosfoglicerato y aumentaba el marcaje en la ribulosa-1,5-bisfofato.

Los experimentos de autoradiografías y cromatografías en papel llevados a cabo por el grupo de Calvin no se detuvieron en la regeneración del aceptor del ciclo. Mediante experimentos similares a los ya vistos anteriormente, determinaron el destino del gliceraldehído-3-fostato (triosas fostato) neto de la fijación. El primer carbohidrato libre que aparecía en las cromatografías era la sacarosa. Las posiciones de la fructosa y la glucosa que la conforman no aparecían con radiactividad. Aunque la ausencia de radiactividad en un determinado compuesto no necesariamente implicaba que este no era el intermediario de la síntesis de sacarosa ( fuertemente unido al enzima, por ejemplo); parecía más plausible que los intermediarios en la síntesis de la sacarosa fuesen la glucosa-1-fosfato y la fructosa-6-fosfato.

Tras 10 años de duro trabajo, Calvin y colaboradores habían cerrado finalmente el ciclo al enlazarlo con la producción de la sacarosa.

The long path of carbon in photosynthesis I

21 marzo, 2010 1 comentario

Vamos a empezar un pequeño viaje por la historia del descubrimiento del ciclo de Clavin-Benson, la fase “oscura” de la fotosíntesis. Este proceso despertó el interés de los primeros fisiólogos vegetales desde el s. XVIII. Stephen Hales (1677-1761), quien publicó el primer tratado de fisiología vegetal, intuyó que las plantas “se alimentaban del aire”. Sin embargo, fue Joseph Priestley (1733-1804) quien intentó verificar la certeza de esta intuición. Priestley realizó experiencias en las que introducía en una campana cerrada una vela encendida un ratón y, a veces, una planta verde . Si dejaba la vela y el ratón en la campana, esta se apagaba y el ratón moría, al introducir la planta, el sistema podía permanecer estable durante más tiempo. De estas experiencias concluyó que las plantas revitalizaban el aire flogistificado, alimentándose a su vez de éste. Las conclusiones de Priestley fueron confirmadas posteriormente por Jan Ingelhousz (1730-1799) que demostró que las partes verdes de las plantas fijan CO2 en presencia de luz, pero en la oscuridad realizan el proceso opuesto.

Los primeros intentos de estudiar el mecanismo químico de esta ruta de fijación del CO2 vinieron de Richard Willstätter y Arthur Stoll a principios del S.XX. Como muchos otros científicos de su época, pensaban que la fotosíntesis requería de la combinación del CO2 con la clorofila y  la posterior fotoexcitación y producción de formaldehído que luego polimerizaba a hexosas. El modelo fotoquímico de Willstätter no convenció a Sam Ruben y Martin Kamen de la Universidad de California, Berkeley, que realizaron experimentos de marcaje radioactivo del CO2 con C11 para registrar los productos de períodos breves de fotosíntesis, tratando de identificar la naturaleza del primer compuesto sintetizado. Ruben y Kamen concluyeron que este primer compuesto producido era un ácido carboxílico y no un aldehído puesto que las sustancias marcadas obtenidas precipitaban con iones de calcio o bario y desprendían el CO2 marcado al tratarlas con pirolisis. Aunque con acierto determinaron la naturaleza del primer compuesto (el 3-fosfoglicerato), Ruben y Kamen no llegaron más allá, al  ser la vida media del isótopo utilizado de 22 minutos, dejando escaso tiempo para realizar los complejos análisis orgánicos que se requerían en la determinación de la naturaleza de los compuestos.

Puesto que la corta vida media del C11 resultaba problemática para los experimentos, Kamen y Ruben junto con Ernst Lawrence, se embarcaron en la búsqueda del C14, más estable ( 5730 años). Tras probar todas las rutas nucleares considerables, finalmente tuvieron éxito. En 1942, Andrew Benson se incorporó al grupo de Kamen en Berkeley realizando numerosos experimentos con C11 marcado. Cuando sus compañeros hubieron descubierto el C14, empezó a experimentar con el alga unicelular Chlorella sp y el C 14 ( BaC14O3) recién aislado.

En 1943, Ruben murió en un accidente con fosgeno, dejando la elucidación de la ruta de fijación del carbono sin su líder. En 1945 Melvin Calvin fue reclutado por Ernst Lawrence para continuar con los trabajos sobre la fotosíntesis en el laboratorio de radiación de la Universidad de California. Melvin invitó a Benson a participar en el proyecto. Llevaron a cabo experimentos con pre-iluminación, amplificando  la fijación del CO2, y análisis de los resultados con cromatografías. El enfoque fue fructífero y Melvin Calvin y Andrew Benson presentaron los artículos “The path of carbon in photosynthesis “ falsando definitivamente  la  teoría del formaldehído que había perdurado durante más de 60 años.