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Archive for the ‘Bioquímica’ Category

La promiscuidad catalítica y la halogenación de productos naturales:

26 noviembre, 2010 8 comentarios

Como hemos podido comprobar en anteriores posts, los seres vivientes son unos químicos orgánicos sintéticos excelentes. Los sistemas vivos son capaces de llevar a cabo reacciones con una estereoselectividad milimétrica, generar una diversidad química apabullante y, no menos importante, hacerlo en condiciones muy suaves comparadas con las presiones, la acidez o la temperatura que requieren determinadas síntesis orgánicas in vitro.

En el post de hoy me hago eco de un artículo publicado recientemente en Nature en el que se aprovechan de la diversidad metabólica bacteriana para incrementar la riqueza sintética que las plantas ostentan. Es bien conocido el interés sintético que presentan las halogenaciones en el mundo de los fármacos puesto que nos permiten, sin grandes cambios en la naturaleza química de la molécula, salvar la resistencia al agente químico que los seres vivos acaban desarrollando o modular la potencia del fármaco. Realizar halogenaciones en productos naturales de utilidad farmacológica puede resultar costoso si se lleva a cabo por vías de síntesis orgánica, sin embargo, existen halogenasas bacterianas capaces de halogenar regioselectivamente sustratos mediante un mecanismo redox dependiente de FAD a partir del anión haluro correspondiente. El grupo de O’Connor utiliza estas enzimas para aumentar la versatilidad sintética del metabolismo secundario de la apocinácea (como nuestra amiga Nerium oleander) Catharanthus roseus, que produce a partir de triptófano un conjunto de alcaloides de interés farmacéutico como determinados agentes quimioterapéuticos.

Catharanthus roseus

Ruta de síntesis de alcaloides a partir de triptófano de Catharanthus roseus. En rojo, se indican los pasos y los enzimas añadidos

La aproximación tomada por los autores del artículo pasa por la transformación de la apocinácea en lugar de reconstruir la ruta metabólica de interés (por otro lado parcialmente desconocida) en un chasis de menor complejidad metabólica como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae como hizo el grupo de Ro con la artemisinina.  Utilizando Agrobacterium rhizogenes como vector consiguen plantas con dos halogenasas bacterianas que cloran el indol del triptófano en posición 5 y 7 respectivamente. En el inserto, incluyen la reductasa que permite la regeneración de la flavoproteína así como uno de los enzimas de la ruta modificado para incrementar su promiscuidad catalítica (en el caso de la halogenasa que modifica la posición 5). Con las plantas transformadas y cultivadas en medio enriquecido en cloruro, los autores demuestran que el nuevo producto generado por el sistema introducido es compatible con el resto de enzimas de la ruta cuya promiscuidad catalítica había sido considerada in vitro en trabajos anteriores. Finalmente, se detectaron por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas los productos clorados en la posición de interés. Además de caracterizar cinéticamente los enzimas, los autores demuestran que pueden utilizar bromuro como sustrato in vivo incrementando todavía más las opciones sintéticas de estas plantas trasformadas. En definitiva, un trabajo que abre las puertas a nuevas aproximaciones biotecnológicas basadas en la combinación lineal de rutas existentes en los tres dominios de la vida y en la promiscuidad catalítica de los enzimas que las componen.

 

 

Cromatograma mostrando la detección del producto clorado de interés. Se muestra el patrón, el control y el procedente de las plantas transformadas.

 

 

Cromatogramas correspondientes a extractos de plantas tranformadas cultivadas en presencia de concentraciones crecientes de bromuro. Se observa la presencia de los picos correspondientes al patrón.

 

Referencias:

W. Runguphan, X. Qu and S. E. O’Connor. (2010) Integrating carbon-halogen bond formation into medicinal plant metabolism. Nature 468:461-464

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La aproximación umpolung de la transaminación

22 noviembre, 2010 7 comentarios

El principio de Curie establece que la asimetría de los efectos debe estar presente en la causas, es decir, de una causa simétrica no pueden generarse efectos asimétricos. La asimetría de la causa, por el contrario, no lleva necesariamente a un efecto asimétrico pudiéndose obtener efectos más simétricos que las causas. Como puede verse, de acuerdo con esta intuición, al igual que los griegos pensaban de los números pares, la simetría es poco fecunda al no poder más que engendrar simetría.  Este galimatías de simetría puede ejemplificarse perfectamente en las reacciones de síntesis orgánica en las que intervienen elementos de quiralidad. La aplicación del principio de Curie resultaría de explicar las posibles desviaciones de los productos del racemato (composición equimolecular de ambos enantiómeros) por la intervención de reactivos o entornos quirales que generasen estados de transición de diferente energía desviando la reacción  a uno de los enantiómeros.

 

Uno de los ejemplos más apabullantes de mantenimiento de la asimetría lo encontramos en la homoquiralidad de toda la vida conocida. Los seres vivos que pueblan la tierra utilizan en la construcción de sus biopolímeros sólo uno de los enantiómeros posibles de las unidades químicas que los componen. Esta selectividad genera catalizadores quirales que se imponen a los mecanismos de reacción generalmente simétricos para obtener los monómeros asimétricos.  La homoquiralidad es un argumento a favor de la ancestralidad común de nuestro bioclado y su fortaleza quedará explícita cuando logremos detallar la ruptura espontánea  de la quiralidad que parece presentar la vida.

 

La síntesis de aminoácidos nos puede servir como ejemplo de ruptura de la quiralidad promovida por un catalizador asimétrico en los sistemas vivos. Para ello, repasaremos previamente la reacción de síntesis abiótica de aminoácidos de Strecker. Si queremos sintetizar un aminoácido sencillo como la serina de acuerdo con este mecanismo, debemos partir de su aldehído correspondiente, el glicoaldehído, cuya imina será objeto de una adición nucleofílica de cianuro para obtener un a-aminonitrilo que posteriormente sufrirá hidrólisis resultando en el a- aminoácido.  La síntesis requiere de medio ácido que es proporcionado por uno de los reactivos, el ácido cianhídrico, a su vez, la fuente del nucleófilo (cianuro) que se adiciona al carbonilo. Como detalla la Figura 1, primeramente se forma, en medio ácido, la imina del aldehído, que luego sufre la adición del cianuro.

Figura 1: Mecanismo de reacción de la síntesis de Strecker. Se muestra la formación de la imina y la posterior obtención del nitrilo. (Tomado de http://www.organic-chemistry.org/)

El carbonilo del producto inicial de la reacción presenta un tipo de proquiralidad  conocido como proquiralidad facial, puesto que se genera un carbono quiral por el cambio de hibridación sp2 a sp3 durante la adición. La proquiralidad se conserva en la imina y  la adición puede ser por una de las dos facies o caras –re o si- (Figura 2) dando, si no se presentan asimetrías, una mezcla racémica de los productos. Es en este momento de la reacción en el que se establece la isomería final de los productos puesto que la consecutiva hidrólisis del nitrilo (Figura 3) no produce ningún cambio en la configuración del carbono quiral.

 

Figura 2: Proquiralidad del carbonilo, se indican las caras re y si. (Tomado de http://www.wikipedia.org/)

 

Figura 3: Mecanismo de reacción de la síntesis de Strecker: Se muestra la hidrólisis del nitrilo para obtener el aminoácido. (Tomado de http://www.organic-chemistry.org/)

El mecanismo de biosíntesis de aminoácidos procede de un modo distinto.  Una vez incorporado el amonio como glutamato y glutamina, la transaminación de a-cetoácidos es la etapa que determina la quiralidad de los aminoácidos. En el caso de la serina, la ruta de síntesis habitual (Figura 4) parte del 3-fosfoglicerato de la glicólisis para obtener por oxidación el a-ceto-β-hidroxiácido correspondiente. El 3-fosfohidroxipiruvato será el que se transamine para dar fosfoserina que tras hidrolizarla se obtendrá serina.

Figura 4: Rutas de obtención de serina. (Tomado de (http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html/)

 

La reacción bioquímica de transaminación transcurre de un modo radicalmente distinto al del mecanismo de Strecker al invertir la polaridad del grupo carbonilo. Este tipo de reacciones conocidas como umpolung permiten incrementar la versatilidad química del grupo y poder llevar a cabo reacciones de adición electrófila al mismo. La transaminación acontece en el centro activo de unas proteínas conocidas como transaminasas que presentan como coenzima el fosfato de piridoxal (PLP). El PLP es una piridina tetrasustituida unida al enzima mediante una imina con el e-amino de una lisina del centro activo.  La transaminación ocurre en varias etapas siendo la primera de ellas la recepción del grupo amino del glutamato y la consecuente ruptura de la imina interna con el e-amino. A continuación, el grupo amino libre forma una imina con el a-cetoácido y se produce la pérdida de un protón para dar el intermediario quinoideo (Figura 5) (se asemeja una quinona) que presenta una forma resonante carbaniónica de gran contribución al híbrido de resonancia (podemos interpretar que la carga negativa se encuentra deslocalizada por el anillo, estabilizando el carbanión). En este punto, hemos invertido la naturaleza electrofílica del grupo carbonilo permitiendo la adición de un protón (electrófilo). La reacción termina con la regeneración de la imina interna con la lisina y liberación del aminoácido.

 

Figura 5: Mecanismo de formación del intermedio carbaniónico quinoideo (Tomado de Vederas et Floss, 1980).

Como hemos visto, la reacción de transaminación presenta diferencias sustanciales con la síntesis de Strecker, tanto en los productos de partida  e intermedios (aldehídos vs a-cetoácidos) como en la reactividad del  grupo carbonilo (adición nucleófila vs adición electrófila), sin embargo la diferencia de mayor relevancia biológica la encontramos en la estéreoespecificidad. De nuevo, la imina presenta proquiralidad facial, pero a diferencia que en el mecanismo de Strecker, sólo una de las caras es atacada. Las transaminaciones catalizadas por enzimas conservan la asimetría preservando la homoquirliadad de los polímeros biológicos. La conservación de dicha quiralidad, a diferencia del racemato producido en la síntesis de Strecker, requiere invocar el principio de Curie y dado que ambos mecanismos propuestos son simétricos la diferencia la deberemos buscar en el elemento quiral de la reacción: el enzima.  Quedarnos con esta respuesta seria muy ingenuo por lo que debemos indagar en la naturaleza íntima de la asimetría. Dentro de las explicaciones propuestas, el efecto de la matriz asimétrica, que es la proteína, en la conformación final del carbono proquiral es la más plausible. La estabilización por resonancia del intermedio carbaniónico exige la perpendicularidad del grupo entrante (o saliente) para la correcta interacción con el sistema p de la molécula (Figura 6). De acuerdo con esta restricción, la matriz proteica fija la conformación mediante interacciones del carboxilo cetoácido con una arginina conservada, exponiendo sólo la cara adecuada a la protonación (Figura 7).

Figura 6: Efecto estereoelectrónico en la orientación de los sustituyentes. Se observa como el enlace a formar o romper debe encontrarse perpendicular al anillo para lograr el máximo solapamiento con el sistema  (Tomado de Toney, 2004).

Figura 7: Fijación de la configuración del C por interacción del carboxilo con el enzima (E+). Se muestra como un cambio en la esteroquímica del carbono cambia el grupo reactivo perpendicular al sistema  (Dunathan,1966).

De este modo, el catalizador asimétrico mantiene la fecunda asimetría de los sistemas biológicos y cuya explicación final es uno de los grandes misterios de la química prebiótica de nuestro tiempo.

Referencias:

M. I. Ávalos. (2004) Symmetry breaking: an epistemological note. Tetrahedron: Asymmetry 15:3171-3175

H. C. Dunathan. (1966) Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 55:712

A. Strecker. (1850) Ueber die künstliche Bildung der Milchsäure und einen neuen, dem Glycocoll homologen Körper. Justus Liebigs Ann.Chem. 75:27-45

M. D. Toney. (2005) Reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. Arch.Biochem.Biophys. 433:279-287

J. C. Vederas and H. G. Floss. (1980) Stereochemistry of pyridoxal phosphate catalyzed enzyme reactions. Acc.Chem.Res. 13:455-463

 

 

No tan sinónimos

22 septiembre, 2010 5 comentarios

La complejidad de los sistemas vivos en niveles de regulación nunca deja de sorprendernos. Esta semana se ha publicado en science un artículo acerca del sorprendente destino de dos proteínas (β-actina y γ-actina) con una secuencia aminoacídica casa idéntica y que presentan funciones celulares distintas virtud regulación diferencial por estar la isoforma β arginilada (se le ha añadido cotraduccionalmente al extremo N terminal una arginina). Lo verdaderamente intrigante en relación a estas proteínas es cómo puede presentarse sólo una de las isoformas arginiladas si ambas presentan casi los mismos aminoácidos. La respuesta al problema parece hallarse en las secuencias, pues ambas proteínas se encuentran codificadas en genes distintos y presentan notables diferencias a nivel nucleotídico. De este modo, Zhang et al evaluaron computacionalmente discrepancias a nivel de plegamiento del mRNA de las proteínas prediciendo una menor tasa de traducción para la γ-actina. Paralelamente, llevaron a cabo experimentos para esclarecer el papel de esta traducción más lenta en la ausencia de γ-actina arginilada. De acuerdo con los experimentos del grupo de Zhang, la menor tasa de traducción conllevaba la exposición de una lisina el tiempo suficiente como para ser ubiquitinada y degradada posteriormente por el proteasoma. Aunque queda mucho trabajo por hacer para confirmar este mecanismo, estos indicios abogan a replantearse una vez más acerca de qué entendemos por sustitución sinónima y cómo de robustos son realmente los sistemas celulares.

Differential Arginylation of Actin Isoforms Is Regulated by Coding Sequence–Dependent Degradation , Fangliang Zhang, Sougata Saha, Svetlana A. Shabalina, and Anna Kashina Science 17 September 2010: 1534-1537.

Alcanos bacterianos

3 agosto, 2010 52 comentarios

La escasez de los combustibles fósiles está impulsando toda aquella investigación cuyos subproductos puedan quemarse en un motor de combustión. Gracias o no a esta situación, esta semana se ha publicado en science un trabajo que identifica y caracteriza los enzimas responsables de la síntetis de alcanos en cianobacterias. Los modelos estudiados hasta ahora con dicha actividad eran eucariotas (podemos encontrar alcanos en la cutícula de las hojas o como feromonas) sin embargo, había indicios fuertes de que dicha actividad se encontraba presente en diversos grupos de cianobacterias. El grupo de Schirmer utilizó los abundantes datos genómicos de este phylum para identificar a los enzimas responsables de dicha actividad. Primeramente, cultivaron 11 cianobacterias de genoma conocido y evaluaron la presencia de alcanos en los cultivos. De los positivos, intersectaron sus genomas y encontraron diversos genes con función desconocida comunes a todos las bacterias cultivadas. De los genes hipotéticos más plausibles dos resultaron ser los correspondientes a las enzimas implicadas en la síntesis, en la que un ácido graso se reduce a aldehído para luego descarboxilarse. La función de los genes putativos se confirmó mediante estudios knock in en Escherichia coli y knock out en Synechocystis sp.

A la izquierda los cromatogramas del control y el knock out para Synechocystis sp. A la derecha la ruta de síntesis de alcanos con los enzimas descubiertos.

El estudio se completó caracterizando cinética y mecanísticamente las enzimas implicadas. De nuevo un trabajo completo que da gusto leer y que abre nuevos caminos en el campo de los biocombustibles.

A. Schirmer, M. A. Rude, X. Li, E. Popova and S. B. del Cardayre. (2010) Microbial Biosynthesis of Alkanes. Science 329:559

Diseño de enzimas: las Diels-Alderasas

21 julio, 2010 11 comentarios

La reacción de Diels-Alder es de excepcional importancia en química orgánica puesto que es esteroespecífica y regioselectiva y permite obtener una multitud de compuestos cíclicos (incluso heterocíclicos) de gran utilidad en síntesis orgánica. No en vano, les valió a sus descubridores Otto Paul Hermann Diels y Kurt Alder el premio Nobel de química en 1950. La reacción requiere de un dieno conjugado y un dienófilo como reactivos. Se trata de una reacción concertada es decir, no presenta intermedios, y transcurre a través de un estado de transición cíclico.

Esta sencillez mecanística junto con la ausencia de la reacción en los organismos biológicos han motivado a los investigadores del grupo de Siegel a desarrollar un enzima de Novo que catalice dicha reacción. El artículo publicado en Science es un ejemplo de un trabajo excelente tanto a nivel teórico como experimental. El enzima fue diseñado in silico para catalizar una reacción Diels-Alder concreta (sustratos moderadamente solubles) estabilizando el estado de transición gracias a la formación de dos puentes de hidrógeno con los sustratos. Se utilizaron cálculos mecánico cuánticos para evaluar dicha estabilización generada por la modificación de la distribución electrónica. Tras esto se determinaron computacionalmente un centros catalíticos capaces de acomodar los sustratos en la dirección deseada y presentar los residuos catalíticos en la posición adecuada. La aproximación utilizada requiere de una esqueleto proteico como base que soporte el centro catalítico sin provocar grandes distorsiones en la estructura de la proteína. Tras obtener varias Diels-Alderasas, sintetizaron y purificaron dichas proteínas obteniendo con éxito enzimas solubles capaces de catalizar la reacción. El trabajo de Siegel et al se completa caracterizando cinéticamente las enzimas (que muestran una mayor eficiencia catalítica y estereoespecificidad que la reacción sin catalizar) y determinando las causas de las diferencias observadas en cuanto a la catálisis. El trabajo realiza los oportunos controles siendo uno de ellos el determinar la estructura de las proteínas sintetizadas para evaluar como de coherentes son con los modelos computacionales. En definitiva, se trata de una investigación ejemplar en las que experimento y teoría establecen el elegante diálogo que no deja el mal sabor de boca a incompletitud al que nos tienen acostumbrados los artículos científicos.

J. B. Siegel, A. Zanghellini, H. M. Lovick, G. Kiss, A. R. Lambert, J. L. St Clair, J. L. Gallaher, D. Hilvert, M. H. Gelb and B. L. Stoddard. (2010) Computational Design of an Enzyme Catalyst for a Stereoselective Bimolecular Diels-Alder Reaction. Science 329:309

La DNA polimerasa η (eta), una heroína discreta

DNApol III

Hace unos meses repasaba con mi hermana el mecanismo general de la replicación del DNA, para una mejor visualización de cara a un examen de Biología y Geología. Veíamos cómo la polimerasa de DNA utilizaba como molde una de las cadenas para sintetizar una nueva hebra. Sin duda, se trata de un proceso elegante e intuitivo (incluso fue propuesto por Watson y Crick en el artículo de 1953 en el que se dio a conocer la estructura del DNA) que cautiva al contemplarlo por primera vez, aun en modelos sencillos. Pero qué cara me hubiese puesto mi hermana si le hubiese contado que existen unas cinco polimerasas diferentes en procariotas y aproximadamente quince en eucariotas. Seguro que, a pesar de su patente interés, después de mirarme con los ojos como platos se habría ido a ver la tele.

Nosotros también estamos poco acostumbrados a tener en cuenta esta diversidad de polimerasas, y frecuentemente nos limitamos a abstraer el mecanismo a un único ejemplar. Sin embargo, es crucial para nuestra placidez que existan y actúen estas enzimas, con diferencias tal vez sutiles pero funcionalmente distinguibles.

Así, algunas de ellas están especializadas en la reparación de desperfectos en la secuencia nucleotídica del DNA. Por ejemplo, los que son causados por exposición a la radiación ultravioleta. El daño más habitual causado por esta fuente mutagénica es la formación de dímeros de pirimidina (generalmente, timina-timina), que originalmente eran adyacentes, de manera que dejan de aparearse con la hebra complementaria. Esta separación puede provocar una mala replicación o incluso a una detención en la misma, dando lugar a cambios que, de un modo u otro, pueden alterar la secuencia del DNA resultante. En ocasiones, esto puede desencadenar en la aparición de enfermedades como cáncer de piel, lo cual presumiblemente ocurrirá con mayor probabilidad en aquéllos que se expongan más frecuentemente a la luz solar y en los que, como yo, tengan bajas cantidades de melanina.

Pero este efecto desastroso es evitado en gran medida por los heroicos sistemas de reparación celulares, y, con ellos, polimerasas de DNA especiales.  Por esto, cualquier información acerca del funcionamiento de estas macromoléculas puede ayudarnos a comprender el origen y la evasión de enfermedades potencialmente catastróficas. Hace un par de días celebraba Nature la publicación de dos artículos (1, 2) acerca de la dilucidación de la estructura de la DNA polimerasa η (eta). Esta enzima tiene una capacidad sorprendente para pasar a través de estas lesiones (en lo que se denomina síntesis translesión) y continuar la replicación como si de un simple bache en la calzada se tratase. Tras numerosas repeticiones y esfuerzos por vislumbrar su estructura tridimensional, se ha podido comprobar que esta enzima posee un centro activo entre la palma y el dedo (la polimerasa posee la disposición clásica en forma de mano) mayor al de las polimerasas tradicionales, de manera que una lesión abultada, como la del dímero de pirimidinas, cabe perfectamente. Así, mediante un mecanismo eficazmente flexible, puede pasar a través de estas magulladuras moleculares y continuar con la replicación del DNA.

DNA pol η en complejo con un fragmento de DNA que contiene un dímero de pirimidinas.

Personalmente, me satisface leer acerca de avances en el conocimiento de las causas y reparaciones de este tipo de daños en el material genético, ya que es probable que sin saberlo nos enfrentemos a ello a diario, en un combate silencioso. Una guerra de guerrillas en la que el enemigo únicamente lanza guijarros, que penosamente caen y son arrastrados por escobas moleculares. Sólo cabrá preguntarse: ¿cuántas piedras hacen falta para perforar una muralla?