Inicio > Divulgación, Historia de la ciencia, Metabolismo > The long path of carbon in photosynthesis II

The long path of carbon in photosynthesis II

El camino hacía la ruta de la fijación del carbono estaba preparado. El descubrimiento previo del isótopo de C14 y la técnica analítica de la cromatografía en papel bidireccional fueron fundamentales para que el grupo de Calvin realizara experimentos acerca del destino del CO2 fijado en la fotosíntesis. El principio del experimento era sencillo, el CO2 acaba incorporándose en todos los materiales vegetales, principalmente y en primera instancia en los carbohidratos. La intención del grupo de Calvin era reducir el tiempo de viaje de esta molécula para discernir la ruta de fijación del CO2 (pulso y caza). Para ello, se suministraba 14CO2 a un organismo fotosintético y se detenía la reacción a tiempos adecuados matando al organismo con metanol hirviente al 80%. El metanol servía para dos propósitos, detenía la reacción inutilizando los enzimas y extraía los azúcares para su posterior análisis cromatográfico.

Los experimentos preeliminares confirmaron la separación, ya documentada, entre las fases luminosa y oscura de la fotosíntesis. El montaje consistía en un aparato llamado por Calvin y sus colaboradores lollipop, por su forma de piruleta, en el que crecían algas del género Chlorella preilumindas, almacenando suficiente poder reductor como para llevar acabo la fijación de CO2 en las condiciones de oscuridad posteriores. Estos experimentos de corta preiluminación y luego oscuridad eran poco viables al no ir mucho más allá del poder reductor almacenado en ese breve período de tiempo, por eso decidieron hacer experimentos en fotosíntesis en fase estacionaría (CO2 y iluminación constantes).

Las cromatografías se revelaban en una película fotográfica sensible a la radiación del C14. Determinando luego los compuestos con radiactividad incorporada a los diferentes tiempos de iluminación y analizando posteriormente la distribución de la radiación en cada compuesto con el tiempo se podía obtener una familia de curvas del incremento de radiación de cada compuesto respecto al tiempo.

Para determinar la ingente cantidad de compuestos presentes en un organismo fotosintético, se ensayaron numerosos procedimientos. En primera instancia, se utilizaron los métodos analíticos clásicos de la química orgánica, pero la lentitud y el requerimiento de grandes cantidades de material biológico para el análisis hicieron que fueran sustituidos por otros procedimientos. Dada la experiencia del grupo de Calvin en los años de guerra en separar plutonio y otros elementos radiactivos en columnas de intercambio iónico, utilizaron este método para determinar que los compuestos marcados a tiempos cortos eran de naturaleza aniónica. Debido a la dificultad en eluir después los componentes radiactivos de las resinas, parecía plausible que el material era de naturaleza acídica, disponiendo de varios puntos de unión a la resina.  Aunque esta técnica presentaba resultados, se necesitaba de otra que permitiese resolver a la vez todos los componentes del extracto en menos tiempo.

La técnica de la cromatografía bidimensional en papel permitía la separación de aminoácidos, azúcares y otros compuestos. Al grupo de Calvin le sirvió para analizar de manera rápida los productos marcados presentes en los extractos de algas fotosintéticas. El fundamento de esta técnica subyace en la pérdida de agua de la solución solvente a medida que se desplaza por el papel. Las separaciones son el  resultado de la partición entre la fase orgánica en movimiento y la fase acuosa estacionaria. El coeficiente de partición de cada sustancia es particular y puede proporcionarnos información para identificarlo. De este modo, la solución se vuelven más orgánica, separándose los solventes aniónicos, como los azúcares fosfatos, con el solvente rico en agua mientras que los más hidrofóbicos como los lípidos y los pigmentos permanecen en la fase orgánica. El uso de dos solventes diferentes y la rotación del papel 90º ( cromatografía bidimensional), permitía una resolución de las sustancias similares. Las cantidades relativas de los compuestos se podían determinar cualitativamente de las autoradiografías o cuantitativamente previa elución. Se realizaban cromatografías paralelas con compuestos patrones para ayudar a establecer las propiedades de la manchas.

Los primeros resultados de estas cromatografías mostraron que, en apenas 30 segundos, el carbono marcado había pasado a una gran variedad de compuestos. Si querían obtener la relación temporal entre las distintas sustancias debían acortar el tiempo de exposición. Efectivamente, al reducir el tiempo, algunos de estos compuestos no mostraban radiactividad, indicando que se trataba de compuestos que se sintetizaban en pasos tardíos de la ruta de fijación del carbono. El primer producto de la fotosíntesis, cuando el tiempo de esta se reducía  a apenas unos segundos, era un ácido carboxílico, el 3-fosfoglicerato, tal y como lo encontraron Ruben y Kamen.

Se disponía del inicio del ciclo, del primer producto de la fijación del CO2, siendo la determinación del aceptor el próximo compuesto a determinar. La degradación de los intermediarios marcados, permitía establecer la cantidad de radiación en cada carbono del compuesto. De este modo, se llegó a establecer que el 3-fosfoglicerato estaba inicialmente marcado en el grupo carboxilo. Es fácil de ver por qué Calvin y sus colaboradores pensaron que el aceptor inicial era un compuesto de dos carbonos. En la búsqueda de este aceptor de dos carbonos se identificaron muchos de los otros compuestos que aparecían en las cromatografías. Tras realizar muchos experimentos, aparecieron dos nuevas manchas que no correspondían con ninguno de los compuestos que ya conocían. La primera mancha desconocida resultó ser para su sorpresa, un azúcar de siete carbonos, la sedoheptulosa, recibiendo confirmación por comparación con sedoheptulosa de Arnold Nordal. El segundo compuestos era la ribulosa-1,5- bisfosfato, ninguno de ellos el compuesto C2.La búsqueda fútil del compuesto C2 terminó cuando consideraron la posibilidad de que el aceptor inicial fuese un compuesto con cinco carbonos. Estudiando el marcaje radioactivo de los carbonos de la sedoheptulosa y la ribulosa-1,5-bisfosfato, establecieron las rutas de síntesis de estos compuestos a partir de  combinaciones de otros compuestos identificados.

Aun habiendo determinado los caminos por los cuales se podían generar todos los intermediarios del ciclo; pentosas, hexosas y  heptosas, se presentaba el problema adicional de que todos ellos aprecian simultáneamente junto con la triosa. Para dilucidar finalmente quien era el aceptor inicial del ciclo decidieron utilizar datos cinéticos. Se apoyaron en el hecho que los compuestos se saturaban con radiactividad muy rápidamente indicando que eran las concentraciones de estos en estado estacionario. Los efectos de la luz en las concentraciones de los intermediarios sirvieron para determinar el aceptor del ciclo. Para probarlo bidireccionalmente, se hicieron experimentos similares en los que el alga era suministrada CO2 marcado y luego era transferida atmósferas con CO2 ausente, se detectaba la disminución de la mancha del 3-fosfoglicerato y aumentaba el marcaje en la ribulosa-1,5-bisfofato.

Los experimentos de autoradiografías y cromatografías en papel llevados a cabo por el grupo de Calvin no se detuvieron en la regeneración del aceptor del ciclo. Mediante experimentos similares a los ya vistos anteriormente, determinaron el destino del gliceraldehído-3-fostato (triosas fostato) neto de la fijación. El primer carbohidrato libre que aparecía en las cromatografías era la sacarosa. Las posiciones de la fructosa y la glucosa que la conforman no aparecían con radiactividad. Aunque la ausencia de radiactividad en un determinado compuesto no necesariamente implicaba que este no era el intermediario de la síntesis de sacarosa ( fuertemente unido al enzima, por ejemplo); parecía más plausible que los intermediarios en la síntesis de la sacarosa fuesen la glucosa-1-fosfato y la fructosa-6-fosfato.

Tras 10 años de duro trabajo, Calvin y colaboradores habían cerrado finalmente el ciclo al enlazarlo con la producción de la sacarosa.

  1. Tania
    12 marzo, 2013 a las 21:55

    (Que esto quede entre biólogos), acabo de leer esta entrada y me enamoré.
    Sólo puedo decir una cosa: Tienes una nueva fan.
    Tienes un blog DEMASIADO interesante.
    BioSaludos!

  1. 29 junio, 2015 a las 04:32

Responder

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s

A %d blogueros les gusta esto: